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唐草片水溶性成分HPLC指纹图谱研究
发表时间:2013-10-30

 

周淑琴1,杨莉娅2,姚虹1,熊野娟1,张一芳1,唐浩1

(1.上海医药高等专科学校药学系,上海2013182.上海百岁行药业有限公司,上海201700)

 

摘要:目的  建立唐草片(老鹳草、金银花、瓜蒌皮等)水溶性成分的高效液相色谱指纹图谱。方法  采用Agilent 1200 Zorbax TC-C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm),以甲醇-0.2%磷酸水为流动相梯度洗脱,检测波长为330 nm,体积流量为0.7mL/min。结果  建立了唐草片水溶性成分HPLC指纹图谱,标定了20个共有指纹特征峰,方法学考察符合指纹图谱技术要求。结论  方法稳定可靠,精密度高,重复性好,可为唐草片质量标准的制订提供科学依据。

关键词:唐草片;水溶性成分;HPLC;指纹图谱;抗艾滋病药

中图分类号:R286    文献标志码:B    文章编号:1001-1528(2012)05-0971-03

 

    唐草片是由老鹳草、金银花、瓜萎皮等二十味中药组成的抗艾滋病药[1-4],具有清热解毒,活血益气,延缓病毒复制,提高艾滋病药患者CD4细胞数量,有效改善病人的腹泻、失眠、食欲不振、乏力、脱发、消瘦、皮肤溃烂等临床症状,提高患者生话质量[5-6]。但是,它的质量受药材的产地、采摘时间和生产工艺等因素的影响而波动,目前是采用高效液相法测定单指标成分绿原酸来控制唐草片的质量[7],不能全面反映其内在质量。中药指纹图谱是一种可量化的、综合性的色谱鉴定手段[8-9],本实验采用HPLC法建立了唐草片水溶性成分的指纹图谱,确定共有峰。经方法学考察分析,该方法稳定性好,精密度高,重复性好,可用于唐草片的质量控制,为唐草片质量标准的制订提供依据。

 

1 仪器与试药

Agilent 1200高效液相色谱仪;二极管阵列检测器;Chemslation化学工作站;SK3310LHC超声清洗器(上海科导超声仪器有限公司);TDL-5-A低速大容量离心机(上海安亭科学仪器厂):Direct-Q5 Millipore超纯水系统;AI204型电子天平(瑞士METTLER TOLEDO仪器有限公司)。

绿原酸和阿魏酸对照品(批号分别为110753-200413、110773-200611)均来自中国药品生物制品检定所;甲醇为色谱纯(美国默克公司);其余试剂为分析纯(国药集团化学试剂有限公司提供);水为超纯水。

唐草片供试品由上海百岁行药业有限公司提供,批号100301、100401、100501、100601、10070l、100901、100902、101001、101002、101101、101102、101201。

2 方法与结果

2.1  色谱条件

Agilent 1200 Zorbax TC-C18色谱柱(4.6mm x250 mm,5μm);流动相为甲醇(A)-0.2%H3PO4(B)的水溶液,进行梯度洗脱,程序为0-15 min为20%A-40%A,15-25 min为40%A~50% A,25~45 min为50%A~70%A,45~55 min为70%A一80%A,55—85 min为80% A一100%A;进样量10μl;检测波长330 nm;柱温35℃;体积流量0.7 mL/min。

2.2  对照品溶液的制备  

精密称取经五氧化二磷真空干燥 12h的绿原酸和阿魏酸对照品,用甲醇溶解后定容于10 mL棕色量瓶中,配成含绿原酸3.73 mg/mL和阿魏酸0.29 mg/mL的对照品混合溶液,用0.45μm微孔滤膜滤过,取续滤液.即得。

2.3  供试品溶液的制备  

取唐草片20片,研细,取约1.0g,精密称取,置于三角烧瓶中,加入40 mL水,称定质量,35℃超声提取45 min,放冷后,再称定质量,用水补足减失的质量,离心,取上清液倾人50 mL量瓶中,用水稀释至刻度,摇匀,静置,取经0.45μm 微孔滤膜滤过的续滤液,即得。

2.4方法学考察

2.4.1稳定性试验 

取同一供试品溶液(批号100301)10μL,按2.1项方法操作,分别在0、2、4、6、8、12、24h进样,记录HPLC图谱。分析计算各共有峰的保留时间和峰面积,结果保留时间和峰面积的RSD值分别小于0.5%和2.6%。表明唐草片供试液在24 h内稳定,实验结果可靠。

2.4.2精密度试验 

取同一供试品溶液(批号100301)10μL,按2.1项方法连续进样6次,记录指纹图谱。考察各共有色谱峰的保留时间和峰面积,结果保留时问和峰面积的RSD值分别小于0.7%和2.7%。表明仪器精密度良好。

2.4.3重复性试验 

取同一批供试品((批号100301)6份,按2.1项方法操作,记录指纹图谱。考察各共有色谱峰的保留时间和峰面积,结果保留时间和峰面积RSD值分别小于0.2%和2.2%。表明本方法的重复性良好。

2.5指纹图谱的建立及分析

2.5.1供试品测定 

取12批供试品,按2.1项下条件操作,记录HPIC指纹图谱测定。分析12批供试品液的指纹图谱,都有20个稳定的特征峰,并确定其为共有指纹峰,唐草片的HPLC指纹图谱见图1,12批唐草片指纹图谱的重叠图见图2。

2.5.2参照峰的选择 

与对照品进行比较分析,确认6号峰为绿原酸、9号峰为阿魏酸。选取峰面积稳定,出峰时间适中,分离度好的6号峰作为参照峰[10]。以峰6为参照峰(s),计算各批次共有峰的相对保留时间和相对保留峰面积,结果各共有峰的峰号(相对保留时间)分别为:1(0.265)、2(0.299)、3(0.387)、4(0.458)、5(0.582)、6(1.000)、7(1.113)、8(1.194)、9(1.336)、10(1.519)、11(1.663)、12(1.763)、13(1.812)、14(2.008)、15(2.125)、16(2.463)、17(2.508)、18(2.615)、19(3.123)、20(4.158),各批次的相对保留时问的RSD为0.32%-1.93%,符合规定要求;峰号(相对峰面积)分别为:1(0.061)、2(0.051)、3(0.073)、4(0.032)、5(0.308)、6(1.000)、7(0.047)、8(0.046)、9(0.045)、10(0.116)、11(0.069)、12(0.031)、13(0.069)、14(0.137)、15(0.186)、16(0.031)、17(0.190)、18(0.057)、19(0.031)、20(0.083),各批次的相对峰面积的RSD为0.64%-2.84%,也符合规定要求。

2.5.3指纹图谱相似度计算 

使用国家药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件(2004 A版),将12批供试品液的指纹图谱的数据导入,以平均数法生成共有模式图谱。计算各批次供试品的相似度,结果皆大于0.9,符合中药指纹图谱的技术要求[11],见表1。

 

 

 

 

 

 

 

 

3讨论

3.1检测波长的选择

采用二极管阵列检测器,考察和比较了200—360 nm之间的8个波长下的指纹图谱。结果表明,在330 nm下检测到最多的指纹图谱信息,各峰的分离度较好,因此,检测唐草片水溶性成分的波长选定为330 nm。

3.2流动相的选择

比较甲醇-甲酸水溶液、甲醇-磷酸水溶液、甲醇-醋酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液等梯度洗脱系统[12],结果表明乙腈-磷酸水溶液作为流动相,进行梯度洗脱,出峰集中,峰分离度不好,30 min以后提供的信息量较少;甲醇-醋酸水溶液、甲醇-甲酸水溶液对样品中各成分未能实现很好的分离,而甲醇-磷酸水溶液对样品的各组分分离比较完全,因此本实验采用甲醇-磷酸水溶液系统。

3.3流动相体积流量速的选择

考察了3个体积流量对色谱分离的影响,体积流量为1.0 mL/min、0.6 mL/min时,峰的分离度较差,峰形也不好。体积流量为0.7 mL/min时,色谱峰信息量最大,分布适中,所有成分峰均在75min内流出,符合中药注射剂色谱指纹图谱实验研究技术指南的要求。

3.4供试品的处理

结合唐草片的生产工艺,采用超声波提取法[13],以水作为提取溶剂,考察了提取温度、固液比、提取时间三因素,对唐草片水溶性成分提取的影响。当提取温度35℃、固液比为1:50、提取时间为45 min时,得到的指纹图谱信息量大,特征性强,各峰的分离度均大干1.5;同时,以50%、70%、80%的乙醇或甲醇作为提取溶剂,其它条件类似于水提取,得到的指纹图谱信息量很多,各峰的分离度不好,特征性不强。

本实验确定了20个共有峰,计算了12批供试品的相似度,均大于0.9,且各色谱峰保留时间稳定,符合中药指纹图谱的技术要求。表明本试验的方法所建的指纹图谱稳定可靠,精密度高,重复性好,可以作为控制唐草片质量的依据之一。

 

参考文献:

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[3] 王姗姗.瓜蒌皮的药理作用及其临床应用[J].山西医药杂志,2009,38(1):67-68.

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[8] 王苏静,常世卿.中药色谱指纹图谱技术与应用[M].郑州:郑州大学出版社,2008:57.

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[11] 国家药典委员会.中药注射剂色谱指纹图谱实验研究技术指南(试行)[S].2002。

[12] 王倩,王建新,于志国,等.金银花药材高效液相色谱指纹图谱研究[J].中成药,2005。27(7):751-754.

[13] 梅林。梅兰.李随丽,正交试验法优化金银花中绿原酸的水提工艺[J].中国药业,2007,16(6):42-43.